作為深層組織和活細胞成像的強大工具，多光子顯微鏡可以簡單分為雙光子顯微鏡（2PM）和三光子顯微鏡（3PM）兩種。相對于2PM，3PM有兩大優勢：一是使用更長波段的激發光源，讓激光在生物組織中有更長的衰減距離；二是通過更高階的非線性激發，減少背景信號的強度。基于這些優勢，3PM大幅提高了多光子顯微成像的穿透深度和圖像信噪比。然而，構造能同時激發多種熒光團的多色3PM遠比2PM更有挑戰性。一般來說，能同時觀察綠色和紅色熒光團的雙色3PM需要兩種不同的激發波長，分別為1300 nm和1700 nm。使用雙波長光源不僅增加了總激發功率和損傷組織的風險，也增加了光學系統的復雜性。因此，發展單一激發波長的多色3PM在生命科學研究中具有重要的實際意義［1］。
科研界普遍認為，綠色和紅色熒光團的吸收峰相去甚遠，但熒光團的三光子吸收譜與單光子吸收譜并不完全一致。三光子截面的峰值相對其單光子吸收峰會藍移數百納米，這為單一波長同時激發綠色和紅色熒光團提供了基礎。
圖1 溶液中Texas Red、SR 101、Alexa Fluor 546、DsRed、tdTomato、mCherry Qdot 605的單光子吸收譜、雙光子及三光子吸收截面
圖1表示一些常見熒光染劑的單光子吸收譜、雙光子和三光子截面。以紅色熒光團Texas Red為例，其單光子吸收峰位于590 nm，雙光子截面與單光子吸收譜類似，而三光子截面峰位于420 nm，對應躍遷到更高的能級。這說明～1300 nm的脈沖也能對紅色熒光團進行有效的三光子激發。如圖2所示，當激發波長低于1260 nm時，熒光團僅激發雙光子信號。隨著激發波長逐漸紅移，激發信號會混合雙光子和三光子的熒光。當波長大于1340 nm，激發信號才以三光子熒光為主。
圖2 Texas Red熒光信號強度與入射激光強度取對數后的斜率與激發波長的關系
圖3是不同激發波長對Texas Red標記小鼠大腦血管的多光子圖像。如圖所示，隨著波長從1220 nm到1340 nm，三光子熒光信號的比例逐漸上升，圖像的信噪比也逐漸上升。1650 nm激發的三光子熒光圖像相較于1340 nm信噪比有略微的下降，原因是1650 nm的三光子截面要低于1340 nm。
圖3 Texas Red標記小鼠大腦血管的多光子圖像
圖4 在1340 nm激發下的多色三光子熒光圖像。
圖4 顯示了單一1340 nm波段激發的多色三光子圖像。其中GCaMP6標記小鼠大腦中的神經元、Texas Red標記血管，三倍頻信號則主要觀察紅細胞和髓磷脂。由于所有通道均為三光子激發的過程，圖像信噪比優越。
總而言之，基于1340 nm的新型三光子激發方案，不僅有出色的多色成像能力，還對常見的紅色熒光分子有超過10倍的信號增強。這將為三光子顯微鏡在生命科學應用的拓展提供新的機遇。
參考文獻
［1］ Multicolor three－photon fluorescence imaging with single－wavelength excitation deep in mouse brain． Science Advances 7， eabf3531 （2021）．
